阿尔茨海默氏病患者血清APP 变化的初步研究

【论文摘要】目的：观察阿尔茨海默氏病（AD）患者血清APP的变化。方法：根据美国国立神经病学、语言障碍和卒中－老年性痴呆和相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)标准，分别筛选老年性痴呆组（AD）11例、血管性痴呆组（VD）11例和正常老年人对照组（NC）8例。用Western-blot的方法，对血浆中APP进行定性和半定量分析。结果：ECL化学发光显影后，比较三组之间条带的光密度显示：AD组血浆APP平均光密度值高于VD组和NC组（P<0.05），VD组和NC组之间无显著差异（P>0.05）。结论：AD患者血浆APP浓度高于VD患者和正常老年人，AD患者血浆APP增高的机制与其他脑组织损伤性疾病不同，可能有其独特的机制。

【论文关键词】 阿尔茨海默氏病；淀粉样蛋白前体；血浆；免疫印迹

The study of APP in plasma of patients with Alzheimer’s disease

He Hong-bo， Fan Ni， Jia Yan-bin， Xiao Ji-hua， Gong Mei-en. The 2nd Affiliated hospital of Guangzhou Medical College， Guangzhou 510260， China

【Abstract】Objectives: To investigate the changes of APP in plasma from Alzheimer’s disease. Methods: According to the diagnostic standards of NINCDS-ADRDA， we selected 30 subjects， including 11 AD patients， 11 VD patients and 8 normal controls， to make the qualitive and quantitive analyses of β-tubulin and APP in plasma by using Western blotting. Result: After exposure to film， we compared AOD among three groups(AD， VD and NC)， showing that in plasma， APPAD>APPVD（P<0.05），APPAD>APPNC(P<0.05)。Conclusion: The plasma concentrations of APP in AD patient is higher than that in VD patient and normal aged， and the reason is different from other brain damaged diseases， which maybe a special mechanism.

【Keywords】 Alzheimer’s disease；amyloid precursor protein（APP）; plasma， Western blotting

AD是一种慢性大脑退行性变性疾病，临床表现为进行性记忆障碍，分析判断能力衰退，情绪改变，行为失常等。神经原纤维缠结（NFT）、老年斑（SP）和选择性神经元及突触丢失是其神经病理改变的主要特征。其中，SP的主要成分是β-淀粉样蛋白（βA），而βA又由β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein， β-APP）异常裂解而产生，所以APP在AD的致病作用受到了充分的重视。本研究采用免疫印迹技术，对AD和正常老年人血清中APP进行定性和半定量分析，以初步探讨AD患者循环系统中APP的改变。

1. 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1正常对照组 男4 例，女4例，年龄（75.13+6.90）岁；简易精神状态检查量表（MMSE）平均评分（26.36+1.36）分；Hachinski缺血指数量表（HIS）平均评分（1.38+0.52）分；全面体检未发现严重躯体疾病，血常规、生化、胸片及ECG检查无异常发现。

1.1.2 AD组 男5 例，女6例，年龄（77.36+7.06）岁；简易精神状态检查量表（MMSE）平均评分（12.37+1.92）分；Hachinski缺血指数量表（HIS）平均评分1.38+0.52 分；由两位经过训练的精神科医师按美国精神病和语言障碍及卒中研究所-瑞士国际神经科学协会（NINCDS-AIREN）1993年制定的AD临床诊断标准，将符合“很可能AD”标准的患者作为AD入组受试。

受试者均来自广州市东山区社会福利院。排除标准：（1）同时伴有严重心、肝、肾、血液和内分泌系统等内科疾病，和其他神经精神科疾病；（2）痴呆严重到无法进行有效的神经认知功能检查者；（3）不愿参加本项研究者。

1.2 研究方法

1.2.1 样品制备 取肘静脉血2ml，3.8%枸橼酸钠1:9(v/v)抗凝，室温下以3000g离心20分钟，取上层血清置－70℃超低温中贮存。

1.2.2 SDS－PAGE （1）配制9％分离胶和5%积层胶，分别室温聚合60分钟和45分钟。（2）用2×SDS加样缓冲液按1﹕1（v/v）稀释待测血清样品，于100℃煮沸5min，1×SDS加样缓冲液溶解预染蛋白质分子量标准混合物，并煮沸3min。（3）将15uL血清样品等体积的加入到样品孔中，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，空置的加样孔中，加入等体积的空白1×SDS样品缓冲液。（4）连接电源，先在100V的恒压下电泳至溴酚蓝前沿到达分离胶，再将电压调整至200V，继续电泳至预染蛋白质分子量标准所示目的分子量出现为止。

1.2.3 电转移 （1）取下凝胶分离胶部分，在转移缓冲液中浸泡30min；剪一块与胶同样大小的NC膜浸泡15－30min。（2）安装电转移设备，从负极到正极，依次放置纤维垫、滤纸、凝胶、NC膜，确保凝胶与滤纸间无气泡。（3）接通电源，室温下，100V电转移60min。

1.2.4 免疫染色及显影（1）取出NC膜，置10ml3％BSA 中，室温下振动60min，然后置于一抗（anti-APP 1:300 ）中孵育，室温下振动60min。（2）用TTBS冲洗液冲洗NC膜数次，置于二抗（Ms Ig(H+L)/HRP 1：10，000；Rb Ig(H+L)/HRP 1：20，000）中孵育，室温下振动60min。（3）TTBS冲洗液冲洗NC膜数次，正面向下浸润在发光底物ECL混合液中5min。（4）暗盒中，NC膜正面向上置于两层保鲜纸之间，取一张X线感光胶片置于保鲜纸上，曝光30sec。（5）暗室中将X线感光胶片放入显影剂中5min，定影剂中10min。

1.2.5图像分析和数据处理 将X线感光胶片摄像，图像用Tiger凝胶图像分析仪检测光密度。用SPSS10.0进行数据处理。

2 结果

各组血浆APP相对含量的单因素方差分析结果（X+S）